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寨卡病毒實驗室檢測技術方案
來源: 中國CDC網站 日期: 2016-9-13 作者:

    寨卡病毒(Zika Virus)屬黃病毒科(Flaviviridae)黃病毒屬(Flavivirus),呈球形,直徑約為40-70nm,有包膜。基因組為單股正鏈RNA,長度約為10.8Kb,可分為亞洲型和非洲型兩個基因型。
  寨卡病毒病的檢測方法包括病毒核酸檢測、IgM抗體檢測、中和抗體檢測和病毒分離等。寨卡病毒與黃病毒屬其他病毒具有較強的血清學交叉反應,目前主要采用病毒核酸檢測。
  一、檢測對象
  (一)疑似和臨床診斷病例。
  (二)伊蚊成蚊和幼蟲。
  二、樣本采集、保存和運輸
  (一)病例標本采集
  對懷疑感染寨卡病毒的患者,要盡早采集血標本,同時要采集尿液和唾液標本。如果臨床高度懷疑男性為寨卡病毒病,在上述標本無法確診時,可考慮采集精液開展檢測。
  血液標本采集辦法:用無菌真空干燥管,采集患者非抗凝血5 ml,及時分離血清,分裝2管,保存于帶螺旋蓋、內有墊圈的凍存管內,標記清楚后低溫保存,其中1管用于現場實驗室檢測,1管用于上級疾病預防控制機構復核。對病例應盡可能采集雙份血液標本,兩份標本之間相隔14天為宜,住院病例可于入院當天和出院前1天各采集一份。
  尿液標本的采集方法:采集尿液標本10ml,置于無菌50ml塑料尖底離心管中,2000rpm離心5min去沉淀,將上清液分裝至無菌15ml離心管中,每份5 ml。如需采集精液標本,應在采集精液標本前采集尿液標本。
  唾液標本的采集方法:將唾液吐入50ml塑料尖底離心管中,4000rpm離心15min去沉淀,將離心后上清液分裝,分裝2管,每份1 ml,保存于帶螺旋蓋、內有墊圈的凍存管內后保存。
  采集精液開展實驗室檢測時,需采集標本1~2 ml,置于無菌干燥、帶螺旋蓋、內有墊圈的凍存管內后保存。
  (二)蚊媒標本采集
  疫點內采集的伊蚊成蚊及幼蟲,分類鑒定后,填寫媒介標本采集信息表,按照采集地點分裝,每管10~20只。
  (三)標本保存、運送
  如標本能夠在24小時內開展實驗室檢測,應將標本置于2~8℃保存;不能及時檢測的標本應盡快置于-70℃以下保存。
  標本運送時采用低溫冷藏運輸,避免凍融,樣本運輸應遵守國家相關生物安全規定。
  三、檢測方法
  寨卡病毒病的檢測方法包括病毒核酸檢測、IgM抗體檢測、中和抗體檢測和病毒分離等。寨卡病毒與黃病毒屬其他病毒具有較強的血清學交叉反應,目前主要采用病毒核酸檢測。
  開展蚊媒寨卡病毒檢測時,主要對捕獲的伊蚊成蚊或幼蟲進行病毒核酸檢測和病毒分離。
  開展寨卡病毒實驗室檢測時,應同時考慮登革病毒和基孔肯雅病毒感染可能。登革病毒和基孔肯雅病毒實驗室檢測應按照相應的技術指南開展。
  (一)臨床標本檢測
  1.病原學檢測
  病原學檢測主要適用于急性期血液標本,一般認為發病7天內檢測陽性率高。
  (1)核酸檢測:采用熒光定量RT-PCR方法,是目前早期診斷寨卡病毒病的主要檢測手段。可采用中國疾病預防控制中心病毒病所發放的熒光定量PCR試劑或其他商品化試劑盒進行檢測。
(2)病毒分離:將標本接種于蚊源細胞(C6/36)或哺乳動物細胞(BHK21、Vero)進行分離培養,出現病變或5~7天以后,用檢測核酸的方法鑒定病毒。也可使用乳鼠腦內接種進行病毒分離。
  2.血清學檢測
  (1)血清特異性IgM抗體:發病3天后可檢出病毒特異性IgM抗體,但發病7天后檢出率高。可采用ELISA、免疫熒光等方法檢測。IgM抗體陽性,提示患者可能新近感染寨卡病毒,但寨卡病毒IgM抗體與登革病毒、黃熱病毒和西尼羅病毒等黃病毒有較強的交叉反應,易于產生假陽性。
  (2)中和抗體:采用空斑減少中和試驗方法檢測。患者恢復期血清中和抗體陽轉或滴度較急性期呈4倍及以上升高,且排除登革、乙腦等其他常見黃病毒感染,可以確診。
  3.其他標本檢測
  尿液、唾液和精液標本的檢測可用血清病毒RNA提取試劑盒及核酸特異性檢測試劑進行檢測,結果判定同血清標本。
  (二)媒介標本檢測
  1.標本處理
  將分類后的伊蚊成蚊或幼蟲,按照采集地點,每10~20只為一份進行研磨處理。
  2.病毒核酸檢測
  用RT-PCR的方法進行寨卡病毒核酸檢測。
  3.病毒分離
  病毒核酸陽性的標本進行病毒分離。
  四、生物安全
      寨卡病毒按照第三類病原微生物進行管理。凡涉及寨卡病毒的分離、培養、未經培養的感染材料等的操作應在生物安全二級(BSL-2)實驗室進行;滅活材料和無感染性材料的操作可在生物安全一級(BSL-1)實驗室進行。病毒培養物的運輸應滿足國際民用航空組織公布的《危險物品安全航空運輸技術細則》(Doc9284號文件)A類感染性物資的包裝要求,對應的聯合國編號為UN2814;未經培養的感染性材料(包括患者血、尿液、唾液或動物體液標本以及現場采集的媒介生物標本等)運輸時應滿足B類感染性物質的包裝要求,對應的聯合國編號為UN3373。開展相關運輸活動須按照原衛生部發布的第45號令《可感染人類的高致病性病原微生物菌(毒)種或樣本運輸管理規定》進行審批后,方可實施運輸。

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